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細(xì)菌耐藥基因blaNDM常見(jiàn)亞型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)
2020-06-24
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返回列表本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了細(xì)菌耐藥基因blaNDM常見(jiàn)亞型(blaNDM-1、blaNDM-4、blaNDM-5和blaNDM-9)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)檢測(cè)技術(shù)的操作步驟。
規(guī)范性引用文件：
《GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》、《GB/T 16489 水質(zhì) 硫化物的測(cè)定 亞甲基藍(lán)分光光度法》。
試驗(yàn)原理
本標(biāo)準(zhǔn)所應(yīng)用的試驗(yàn)原理為：根據(jù)序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物特異性識(shí)別靶序列上六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在Bst DNA聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，大量合成目標(biāo)DNA的同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀產(chǎn)生，可以實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增和快速檢測(cè)，結(jié)果通過(guò)肉眼即可判定。
儀器設(shè)備
1、微量移液器：10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。
2、低溫高速離心機(jī)：離心力20 000 g。
3、電熱恒溫水浴鍋。
4、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀。
5、水平電泳槽。
6、凝膠成像系統(tǒng)。
7、電子分析天平：精度0.001 g。
樣品
在生物安全柜中，將采集的樣品(如人或動(dòng)物的肛拭子、鼻拭子或肝臟、脾 臟、腦等不同臟器組織等)無(wú)菌劃線特異性篩選培養(yǎng)基或哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)12 h～18 h，獲得細(xì)菌單菌落，經(jīng)二次純化后，挑取單菌落于BHI營(yíng)養(yǎng)肉湯中過(guò)夜培養(yǎng)12 h～18 h，用于提取細(xì)菌基因組DNA。
DNA的提取
規(guī)范性引用文件：
《GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》、《GB/T 16489 水質(zhì) 硫化物的測(cè)定 亞甲基藍(lán)分光光度法》。
試驗(yàn)原理
本標(biāo)準(zhǔn)所應(yīng)用的試驗(yàn)原理為：根據(jù)序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物特異性識(shí)別靶序列上六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在Bst DNA聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，大量合成目標(biāo)DNA的同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀產(chǎn)生，可以實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增和快速檢測(cè)，結(jié)果通過(guò)肉眼即可判定。
儀器設(shè)備
1、微量移液器：10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。
2、低溫高速離心機(jī)：離心力20 000 g。
3、電熱恒溫水浴鍋。
4、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀。
5、水平電泳槽。
6、凝膠成像系統(tǒng)。
7、電子分析天平：精度0.001 g。
樣品
在生物安全柜中，將采集的樣品(如人或動(dòng)物的肛拭子、鼻拭子或肝臟、脾 臟、腦等不同臟器組織等)無(wú)菌劃線特異性篩選培養(yǎng)基或哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)12 h～18 h，獲得細(xì)菌單菌落，經(jīng)二次純化后，挑取單菌落于BHI營(yíng)養(yǎng)肉湯中過(guò)夜培養(yǎng)12 h～18 h，用于提取細(xì)菌基因組DNA。
DNA的提取
收集過(guò)夜培養(yǎng)的待檢細(xì)菌菌液1 mL(菌液濃度的OD600值大于1.0)到1.5 mL的EP管中，12 000 g離心2 min，徹底棄上清，取沉淀用商品化的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組總DNA，最后溶于50 μL滅菌水中，測(cè)定DNA的濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>
電泳及結(jié)果判定
保持穩(wěn)定電壓80 V，電泳20 min，電泳反應(yīng)結(jié)束后，在陽(yáng)性和陰性對(duì)照成立的情況下，出現(xiàn)瀑布樣條帶的泳道判為陽(yáng)性，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有超級(jí)細(xì)菌blaNDM基因(參見(jiàn)附錄B：圖1B泳道1和3)，不出現(xiàn)瀑布樣條帶的為陰性
